ترانسفورماسیون برنج (Oryza sativa L.) با ژن‌های گزینشگر هایگرومایسین (hpt) و گزارشگر بتاگلوکورونیداز (gus) به روش In planta

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی سابق کارشناسی ارشد گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم کشاورزی دانشگاه گیلان

2 استادیار گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم کشاورزی دانشگاه گیلان

چکیده

گیـاهان تراریختـه اغلب به وسیله روش­هایی بر پایه کشت بافت تولید می­شوند که روش­های پیچیـده­ای بوده و نیاز به آماده سـازی و انتخـاب دقیق ریزنمونه، انتخاب بافت­های تراریخت شده و باززایی گیاهان تراریخته در شرایط in vitro را دارند. در این آزمایش، گیاهان تراریخته در شرایط غیر استریل تولید شدند. بدین منظور بذور دو رقم برنج بومی تیپ ایندیکا خیسانده شدند تا جنین فعال و شروع به رشد کند. سپس منطقه جنینی با حداقل آسیب به جنین زخم‌زنی و با دو سویه اگروباکتریوم تومه فاشیینس (Agrobacterium tumefaciens) حامل ناقل pCAMBIA1105. 1R تلقیح شدند. القاء ژن‌های vir در محیط کشت خاصی که بدین منظور طراحی شده است انجام شد. بذور بعداً جوانه‌زده و در تحت شرایط غیر استریل رشد کردند. تأیید الحاق ژن انتقالی به درون ژنوم گیاهان تراریخته نسل T0 و T1 با استفاده از روش PCR شامل دو ژن در داخل منطقه T-DNA، مقاومت بافت برگی به آنتی‌بیوتیک هایگرومایسین و آزمون بافت شیمیایی GUS انجام شد. بیشترین کارایی ترانسفورماسیون در نسل T0مربوط به تیمار زخم‌زنی به وسیله خراش با اسکالپل آغشته به اگروباکتریوم  به میزان 72/11 درصد در رقم هاشمی 75/9 درصد بوده است. کارایی ترانسفورماسیون در رقم هاشمی در شرایط سوزن‌زنی همراه با خلاء نیز به طور معنی‌داری از تلقیح تحت شرایط غیرخلاء بیشتر بوده است. به منظور بررسی پایداری ژن تراریخته گیاهان نسل T1به طریق مشابهنسل T0 آنالیز مولکولی شده و نتایج نشان داد که همچنان 19 درصد گیاهان نسل T1تراریخت بوده‌اند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Transformation of rice (Oryza sativa L.) using hygromycin (hpt) selector and β-glucuronidase (gus) reporter genes by in planta method

نویسندگان [English]

  • Tayebeh Salamat 1
  • Somaye Elahi 1
  • Mohammad Mehdi Sohani 2
  • Ali Aalami 2
1 Graduated MSc Student, Dept. of Agricultural Biotechnology, University of Guilan
2 Assist. Prof., Dept. of Agricultural Biotechnology, University of Guilan
چکیده [English]

Transgenic plants are often produced by tissue culture-dependent methods that require careful preparation and selection of explants, selection of transformed cells and regeneration of transgenic plants. In this in planta transformation method, the mature embryos of soaked seed were pierced by an Agrobacterium tumefaciens -coated needle or scalpel. The inoculated seeds were germinated and grew under no sterile conditions. In order to evaluate the effects of cultivars (Hashemi and Gerdeh), A. tumefaciens strains (EHA105 and LBA4404) and Three methods of inoculation (0. 5 mm Ø needle, 0. 5 mm Ø needle together with vacuum infiltration, Wounding with a scalpel) on transformation efficiency. A CRD based factorial experiment with three replications was applied. Integration of the transgene into the genome of transformed plants (T0 and T1) was confirmed using PCR method, resistance of leaf tissues to hygromycin and histiochemical GUS assay. Accordingly, the highest significant transformation efficiency (11. 72 %) was obtained in Hashemi cultivar wounded with a scalpel. Transformation efficiency of the same cultivar inoculated by a needle under vacuum infiltration was significantly higher than treatment of inoculation in the absence of vacuum. Seventy T0 seedlings were selected randomly and analysed further at T1 generation, which ~19% confirmed to be positive.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Acetocyringone
  • Agrobacterium tumefaciens
  • Reporter genes
  • rice
  • Vir genes induction