بهینه سازی بیان موقت ژن به واسطه آگروباکتریوم (Agroinfiltration) در برگ و جوانه گیاه جو (Hordeum vulgare L.)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار، گروه زیست فرآورده های گیاهی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

2 دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه زیست فرآورده های گیاهی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

10.22124/c.2019.12934.1481

چکیده

جو (Hordeum vulgare L.) یکی از مهم­ترین گیاهان زراعی در دنیا است و به­عنوان یک سامانه تولید پروتئین­های نوترکیب نیز در بیوتکنولوژی کشاورزی اهمیت یافته است. در گیاهانی مانند غلات که باززایی و تراریختی آن­ها مشکل است، در برخی موارد بیان موقت یا گذرای ژن به­عنوان جایگزینی برای روش پایدار در نظر گرفته می­شود. بیان موقت ژن توسط آگروباکتریوم (Agroinfiltration)، روشی ارزان و سریع برای بررسی عملکرد ژن­ها و بررسی عملکرد عناصر موثر بر بیان ژن (نواحی ترجمه نشونده، اینترون­ها، عوامل رونویسی و پروموترها) است. با استفاده از این روش، بررسی نحوه کارکرد سازه ژنی فقط با گذشت چند روز و بدون پشت سر گذاردن مراحل وقت‌گیر باززایی گیاه امکان­پذیر است. به­منظور بهینه­سازی این روش در گیاه جو، اثر تیمارهای مختلف مانند نوع بافت، سن گیاه، محل برگ، غلظت استوسیرینگون، زمان بررسی پس از تلقیح، سویه آگروباکتریوم، غلظت (OD) محیط القا، نوع روش، مدت زمان فعالیت پمپ خلا و تعداد آن و نیز ژنوتیپ بر بیان موقت ژن گزارشگر  ß-glucuronidaseدر برگ گیاه جو در این تحقیق بررسی شد. علاوه بر آن، اثر محیط القا، سویه آگروباکتریوم و ژنوتیپ بر بیان موقت ژن گزارشگر در جوانه گیاه جو نیز مورد مطالعه قرار گرفت. بیان موقت ژن ß-glucuronidase در تمامی نمونه­های جوانه رقم بهمن و ژنوتیپ EC-82-6 گیاه جو که با سویه GV3301 آگروباکتریوم واجد این سازه در محیط القا با غلظت استوسیرینگون 200 میکرومولار به­وسیله سوزن انسولین تلقیح شده بودند، مشاهده شد. بر اساس نتایج این تحقیق، یک روشی کارا و ارزان قیمت برای بیان موقت در گیاه جو با استفاده از آگروباکتریوم معرفی می­ شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Optimization of transient expression by Agrobacterium (agroinfiltration) in leaves and buds of barley (Hordeum vulgare L.)

نویسندگان [English]

  • Kasra Esfahani 1
  • Matin Adel 2
  • Tahmineh Lohrasebi 1
1 Assist. Prof., Dept. of Plant Bioproducts, Institute of Agricultural Biotechnology (IAB), National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran
2 Graduated M. Sc., Dept. of Plant Bioproducts, Institute of Agricultural Biotechnology (IAB), National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran
چکیده [English]

Barley is one of the most important crops in the world and is also important in agricultural biotechnology as a recombinant protein production platform. In plants such as cereals, whose regeneration and transformation are difficult, in some cases transient gene expression is considered as a substitute for the stable method. Agrobacterium-based transient expression (agroinfiltration) is an inexpensive and quick way to study the function of genes and to evaluate the elements that affect gene expression (untranslated regions, introns, transcription factors and promoters). By using this method, it is possible to evaluate the function of gene constructs without time-consuming process of plant regeneration only within a few days. In order to optimize this method in barley, the effect of different treatments such as tissue type, plant age, leaves position, acetosyringone concentration, type of induction medium, time of assay after induction, Agrobacterium strain, OD of induction medium, type of procedure, duration and frequency of vacuum pump operation and barley genotype on transient expression of the ß-glucuronidase reporter gene in leaves were evaluated in this research. Also, the effect of type of induction medium, Agrobacterium strain and barley genotype on transient expression of the reporter gene in buds were evaluated. Transient gene expression of ß-glucuronidase were observed in all bud samples of Bahman cultivar and EC-82-6 genotype of barley which were inoculated with GV3301 strain harboring the reporter gene construct suspended in the induction medium with acetosyringone concentration of 200 uM by using insulin syringe. According to the results of this study, an effective and low-cost Agrobacterium-based transient expression system in barley is introduced.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Gene transformation
  • Reporter gene
  • Transcription factors
Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Cermak, T., Atkins, P. A. and Voytas, D. F. 2014. DNA replicons for plant genome engineering. The Plant Cell 26: 151-163.##Bond, D. M., Albert, N. W., Lee, R. H., Gillard, G. B., Brown, C. M., Hellens, R. P. and Macknight, R. C. 2016. Infiltration-RNAseq: Transcriptome profiling of Agrobacterium-mediated infiltration of transcription factors to discover gene function and expression networks in plants. Plant Methods 12: 41.##Canto, T. 2016. Transient expression systems in plants: Potentialities and constraints. In: Vega, C. M. (Ed.). Advanced technologies for protein complex production and characterization. Springer, Cham. pp: 287-301.##Dahleen, L. S. and Manoharan, M. 2007. Recent advances in barley transformation. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 43: 493-506.##Gao, C. and Nielsen, K. K. 2013. Comparison between Agrobacterium-mediated and direct gene transfer using the gene gun. In: Sudowe, S. and Reske-Kunz, A. B. (Eds.). Biolistic DNA Delivery. Humana Press, Totowa, NJ. pp: 3-16.##Fischer, R. and Schillberg, S. 2004. Molecular farming: Plant-made pharmaceuticals and technical proteins. John Wiley and Sons.##Goedeke, S., Hensel, G., Kapusi, E., Gahrtz, M. and Kumlehn, J. 2007. Transgenic barley in fundamental research and biotechnology. Transgenic Plant Journal 1: 104-117.##Hinchliffe, A. and Harwood, W. A. 2019. Agrobacterium-mediated transformation of barley immature embryos. In: Harwood, W. A. (Ed.). Barley. Humana Press, New York, NY. pp: 115-126. #3Jefferson, R. A. 1987. Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Molecular Biology Reporter 5: 387-405.##Lee, M. W. and Yang, Y. 2006. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. In: Salinas, J. and Sanchez-Serrano, J. J. (Eds.). Arabidopsis protocols. Humana Press, Totowa, NJ. pp: 225-229.##Mrízová, K., Holasková, E., Öz, M. T., Jiskrová, E., Frébort, I. and Galuszka, P. 2014. Transgenic barley: A prospective tool for biotechnology and agriculture. Biotechnology Advances 32: 137-157.##Mohammadhassan, R., Esfahani, K. and Kashefi, B. 2018. Constructional and functional evaluation of two new plant expression vectors - pBI121gus-6 and pBI1215+1. Banat's Journal of Biotechnology 9: 60-68.##Mortimer, C. L., Dugdale, B. and Dale, J. L. 2015. Updates in inducible transgene expression using viral vectors: From transient to stable expression. Current Opinion in Biotechnology 32: 85-92.##Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497.##Norkunas, K., Harding, R., Dale, J. and Dugdale, B. 2018. Improving agroinfiltration-based transient gene expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods 14: 71-85.##Rosenthal, S. H., Diamos, A. G. and Mason, H. S. 2018. An intronless form of the tobacco extensin gene terminator strongly enhances transient gene expression in plant leaves. Plant Molecular Biology 96: 429-443.##Sambrook, J. and Russell, D. W. 2001. Molecular cloning. Cold Spring Harbor, New York.##Sheludko, Y. V. 2008. Agrobacterium-mediated transient expression as an approach to production of recombinant proteins in plants. Recent Patents on Biotechnology 2: 198-208.##Tingay, S., McElroy, D., Kalla, R., Fieg, S., Wang, M., Thornton, S. and Brettell, R., 1997. Agrobacterium tumefaciens‐mediated barley transformation. The Plant Journal 11: 1369-1376.##Zamani, K. 2018. Transient gene expression in plants and its application in molecular farming and functional genomics. Crop Biotechnology 22: 65-79. (In Persian with English abstract).