استفاده از منابع کربن و فنل در محیط کشت به‌منظور القاء بهینه پروموتر ژن‌های بیماری‌زا در Agrobacterium tumefaciens

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 دانشیار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

3 استادیار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم کشاورزی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

چکیده

انتقال ژن به گیاهان با استفاده از Agrobacterium tumefaciens دارای مزایای بسیاری است، اما مشکل مهم این سیستم کارآیی پایین آن است. بر این اساس، یکی از راه‌های بهبود کارآیی، افزایش فعالیت ژن‌های بیماری‌زایی یا vir است که نقش اصلی را در انتقال تراژن به داخل ژنوم گیاه میزبان ایفا می‌کنند. برخی متابولیت­های فنلی و قندها القاگر ژن‌های vir هستند که به­طور سینرژیک عمل می­کنند. در این تحقیق جهت بررسی شرایط بهینه بیان پروموتر ژن­های بیماری‌زا از دو سویه موتانت A. tumefaciens به نام­های (MX243)A348  و A348 (MX311) استفاده شد که در سویه موتانت MX243 ژن گزارشگر فاقد پروموتر lacZکد‌کننده آنزیم β-گالاکتوزیداز با پروموتر ژن‌های virB2 امتزاج یافته (virB2::lacZ) و در سویه موتانت MX311 پروموتر virD2 با ژن گزارشگر فاقد پروموتر lacZامتزاجیافته (virD2::lacZ) است. بر این اساس، فعالیت پروموترهای این دو ژن‌ بیماری‌زا با میزان فعالیت آنزیم β-گالاکتوزیداز تحت سه تیمار قندی گلوکز، مانوز و داکسی­مانوز در ترکیب با تیمار فنلی استوسیرینگون در سطوح مختلف در دو تکرار بیولوژیکی و سه تکرار تکنیکی اندازه­گیری شد. ملاک ارزیابی و مقایسه در این خصوص، کشت سه‌روزه A. tumefaciens شامل مرحله اول رشد رویشی و مرحله دوم القای ژن­های بیماری­زا به‌عنوان پروتکل استاندارد القاء بود. نتایج این آزمایش نشان داد که استفاده از تیمار قندی مانوز در ترکیب با 50 میکرومولار استوسیرینگون برای القای بهینه پروموتر ژن virB2و تیمار قندی مانوز در ترکیب با 100 میکرومولار استوسیرینگون برای القای بهینه پروموتر ژن virD2 بالاترین فعالیت آنزیم β-گالاکتوزیداز را به همراه داشت. همچنین تحت شرایط عدم حضور استوسیرینگون، تیمار قندی گلوکز نسبت به مانوز و داکسی­مانوز قدرت القا و بیان بالاتر پروموتر ژن­های بیماری­زا را داشت. بنابراین، به‌منظور بهبود القا و بیان ژن­های بیماری‌زای virB2 و virD2 پساز مرحله تکثیر رویشی تا زمان هم‌کشتی باکتری و نمونه‌های گیاهی، پیشنهاد می­شود از تیمار قندی مانوز به‌عنوان منبع کربن جایگزین گلوکز در ترکیب با غلظت 50 میکرومولار استوسیرینگون در محیط کشت استفاده شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The use of carbon and phenol sources in the medium for optimal induction of virulence genes promoter in Agrobacterium tumefaciens

نویسندگان [English]

  • Mohammad Sadegh Taghizadeh 1
  • Mohammad Mehdi Sohani 2
  • Reza Shirzadian Khoramabad 3
1 Graduated M. Sc., Dept. of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
2 Assoc. Prof., Dept. of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
3 Assist. Prof., Dept. of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
چکیده [English]

The virulence genes (vir) of Agrobacterium tumefaciens induces by many factors such as specific plant phenolic metabolites and sugars. A number of these factors act synergistically with acetosyringone and causing high expression levels of vir genes. In present research, the induction of virB2 and virD2 gene promoters, were investigated in A348 (MX311) and A348 (MX243) Agrobacterium variants, respectively. The promoter sequences from these vir genes have been fused with a promoterless lacZ gene in a cassettes carrying Tn3. A three-day culture of Agrobacterium was performed, which was included a vegetative growth followed by an induction step. Sugar treatment of glucose, mannose and deoxymannose were used in combination with different concentrations of acetosyringone in the two biological and three technical replications. According to the results, the highest activity of β-galactosidase enzyme attained when the mannose of sugar was used in combination with 50 µM acetosyringone for bacterial strain carrying virB2::lacZ construct. The mannose of sugar treatment in combination with 100 µM acetosyringone treatment, for bacterial strain carrying virD2:: lacZ, induced the highest enzyme activity. The monosaccharides in order of descending vir::lacZ activity in the absence of acetosyringone: glucose > mannose > deoxymannose. According to our observations, we suggested that the mannose of sugar treatment with 100 µM acetosyringone could be utilized for obtaining strong induction of Agrobacterium vir genes in an induction medium.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Acetosyringone
  • β-galactosidase
  • Deoxymannose
  • Enzyme assay
  • Glucose
  • Mannose
Allahi, S., Khodaparast, A. and Sohani, M. M. 2014. Agrobacterium-mediated transformation of Indicarice: A non-tissue culture approach. International Journal of Agriculture Innovations and Research 3 (2): 2319-1473.##Baker, C. J., Mock, N. M., Whitaker, B. D., Roberts, D. P., Rice, C. P., Deahl, K. L. and Sver'yanov, A. A. 2005. Involvement of acetosyringone in plant-pathogen recognition. Biochemical and Biophysical Research Communications 328: 130-136.##Beattie, G. A. and Lindow, S. E. 1995. The secret life of foliar bacterial pathogens on leaves. Annual Review of Phytopathology 33: 145-172.##Bulgakov, V. P., Kiselev, K. V., Yakovlev, K. V., Zhuravlev, Y. N., Gontcharov, A. A. and Odintsova, N. A. 2006. Agrobacterium-mediated transformation of sea urchin embryos. Biotechnology Journal 1: 454-461.##Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G. and Nester, E. W. 1990. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 87: 6708-6712.##Christie, P. J. and Vogel, J. P. 2000. Bacterial type IV secretion: Conjugation systems adapted to deliver effector molecules to host cells. Trends in Microbiology 8: 354-360.##Cornish, A., Greenwood, J. A. and Jones C. W. 1989. Binding protein-dependent sugar transport by Agrobacterium radiobacter and A. tumefaciens grown in continuous culture. Journal of General Microbiology 135: 3001-3013.##De Groot, M. J. A., Bundock, P., Hooykaas, P. J. J. and Beijersbergen, A. G. M. 1998. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology 16: 839-842.##Dixon, R. A. and Paiva, N. L. 1995. Stress-induced phenylpropanoid metabolism. The Plant Cell 7: 1085-1097.##Douglas, C. J., Halperin, W. and Nester, E. W. 1982. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plants cells. Bacteriology Journal 152: 1265-1269.##Douglas, C. J. 1996. Phenylpropanoid metabolism and lignin biosynthesis: from weeds to trees. Trends in Plant Science 1: 171-178.##Gelvin, S. B. 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: The biology behind the “gene-jockeying” tool. Microbiology and Molecular Biology Review 67: 16-37.##Gelvin, S. B. 2006. Agrobacterium virulence gene induction in Agrobacterium protocols. Methods in Molecular Biology 343: 77-84.##Gelvin, S. B. 2012. Traversing the cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Front Plant Science 3: 52.##Gheysen, G., Angenon, G. and Van Montagu, M. 1998. Agrobacterium-mediated plant transformation: A scientifically intriguing story with significant applications. In: Lindsey K. (Ed.). Transgenic plant research. 2nd ed. Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands. pp: 1-33.##Hamilton, C. M., Frary, C., Lewis, C. and Tanksley, S. D. 1996. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 93 (18): 9975 -9979.##Harighi, B. 2009. Genetic evidence for CheB-and CheR-dependent chemotaxis system in A. tumefaciens toward acetosyringone. Microbiological Research 164 (6): 634-641.##Ishida, Y., Hiei, Y. and Komari, T. 2007. Agrobacterium mediated transformation of maize. Nature Protocol 2 (7): 1614-1621.##Joubert, P., Sangwan, R. S., Aouad, M. E., Beaupere, D. and Sangwan-Norreel, B. S. 1995. Influence of phenolic compounds on Agrobacterium vir gene induction and onion gene transfer. Phytochemistry 40: 1623-1628.##Kunik, T., Tzfira, T., Kapulnik, Y., Gafni, Y., Dingwall, C. and Citovsky, V. 2001. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of theUSA 98: 1871-1876.##Lemaire, K., Van de Velde, S., Van Dijck, P. and Thevelein, J. M., 2004. Glucose and sucrose act as agonist and mannose as antagonist ligands of the G protein-coupled receptor Gpr1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell 16 (2): 293-299.##McCullen, C. A. and Binns, A. N. 2006. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. The Annual Review of Cell and Developmental Biology 22: 101-127.##Miller, J. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, NewYourk. pp:352-355.##Narasimhulu, S. B., Deng, X., Sarria, R. and Gelvin, S. B. 1996. Early transcription of Agrobacterium T-DNA genes in tabacco and maize. The Plant Cell 8: 873-886.##Opabode, J. T. 2006. Agrobacterium-mediated transformation of plants: Emerging factors that influence efficiency. Biotechnology and Molecular Biology Review 1: 12-20.##Pitzschke, A. and Hirt, H. 2010. New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumor formation in plants by plant transformation. European Molecular Biology Organization (EMBO) Journal 29: 1021-1032.##Sohani, M. M., Rezadoost, M. H., Zamani, A. H., Mirzaii, M. R. and Afsharifar, A. R. 2015. High efficiency Agrobacterium-mediated transformation of sour orange (Citrus aurantium L.) using gene encoding Citrus Tristeza virus coat protein. Journal of Applied Horticulture 17: 109-114.##Stachel, S. E., Timmerman, B. and Zambryski, P. 1987. Activation of Agrobacterium tumefaciens vir gene expression generates multiple single-stranded T-strand molecules from the pTiA6 T-region: Requirement for 5′ virD gene products. European Molecular Biology Organization (EMBO) Journal 6 (4): 857-863.##Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M. and Zambryski, P. C. 1985. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature Journal 318: 624-629.##Stachel, S. E. and Zambryski, P. C. 1986. virA and virG control the plant induced activation of the T-DNA transfer process of Agrobacterium tumefaciens. Cell Journal 46: 325-333.##Tzfira, T. and Citovsky, V. 2006. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: Biology and Biotechnology. Current Opinion in Biotechnology 17: 147-154.##Vernade, D., Estrella, A. H., Wang, K. and Van Montagu, M. 1998. Glycine betaine allows enhanced induction of the Agrobacterium tumefaciens vir genes by Acetosyringone at low pH. Journal of Bacteriology 170: 5822-5829.##Winans, S. C., Mantis, N. J., Chen, C. Y., Chang, C. H. and Han, D. C. 1994. Host recognition by the VirA, VirG two-component regulatory proteins of Agrobacterium tumefaciens. Microbiological Research 145: 461-473.##Wise, A. A., Voinov,L. and Binns, A. N. 2005. Intersubunit complementation of sugar signal transduction in VirA heterodimers and posttranslational regulation of VirA activity in Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology 187: 213-223.##Ziemienowicz, A. 2001. Odyssey of Agrobacterium T-DNA. Acta Biochemica Polinica 48: 623-635.